2.1 膜引导性骨再生的发现 引导性骨再生模型的建立为长骨缺损修复研究提供了一个重要的方法。根据Hammerle等[1]报道，最早的引导性骨再生模型是1962 年由Melcher等利用醋酸纤维素膜在鼠下颌骨骨孔上建立的，由于在膜覆盖的骨孔内骨组织再生现象显著，Melcher将其称为屏障膜技术。1982 年Nyman等[3]首次将该技术用于治疗牙周病，并取得显著疗效，即将其称为引导组织再生技术[2]，在以后的口腔科牙种植时，引导性组织再生技术被称之为引导骨再生技术。自此引导性组织再生技术在骨科的应用逐渐受到重视，相关研究开始增多，目前的研究观点均认为膜引导性骨再在骨修复研究方面显示出了独特的优越性，应成为临床治疗骨缺损的重要方法。 2.2 骨缺损治疗的相关概念 骨缺损治疗是对骨折愈合过程中骨再生方式的研究，因此要研究骨再生技术，应该了解和明确以下几个概念。 2.2.1 骨传导 骨传导即骨折愈合过程中的爬行替代理论，此理论沿用已久。组织学表现为新生骨组织的形成，并逐渐在原有坏死骨的吸收表面爬行替代被破骨细胞吸收的坏死骨组织，完成骨折愈合的过程。骨组织工程学上爬行替代的本质为新骨形成时，在骨端间建立一个有利于新生毛细血管、血管周围组织和骨祖细胞长入的三维结构，完成骨折断端骨的重建。骨传导性生长的成骨方式为骨膜成骨，新生骨由骨折远近端逐渐向骨折的中心生长[4]。但是应该指出的是，此种方式难以完成修复大的骨缺损，因其成骨过程缓慢，且成骨生长范围有限。 2.2.2 骨诱导 骨诱导是利用内源性或外源性促骨生长因子的作用，加速成骨过程的技术，此技术是近几十年研究的热点，也取得了很多突破性成果。在一定促骨生长因子的作用下，使自体间充质细胞在骨折处得以募集，并使其朝着形成软骨和骨的方向发展。在促骨生长因子作用于间充质细胞的同时还应强调骨折处应该具备有利于新骨形成的丰富血供环境[5]。骨形态发生蛋白是研究最多，效果最肯定的促骨生长因子，其效果显著，已经成为新的研究促成骨因子作用的标准。另外，转化生长因子β、胰岛素生长因子1、胰岛素生长因子2、血小板衍生生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等在炎性阶段也可进一步刺激间充质细胞聚集、增殖及血管形成。它们在不同时期，不同程度地参与了骨折愈合过程。骨诱导使骨生长的诱导成骨用明显快于传导性成骨。 2.2.3 骨引导 骨引导又称引导性骨再生。即文章所要概述的内容，为有目的利用物理屏障，选择性地使损伤处新生骨组织再生、长入，受损伤骨组织得以修复的技术，已成为修复动物节段性骨缺损的新兴研究方法[6]。骨引导机制为当机体骨折发生后，即开启组织的修复程序，但机体组织再生的速度不同，骨折周围软组织的成纤维细胞修复速度远大于具有成骨功能的细胞向骨缺损内生长的速度，若不采取措施阻止成纤维细胞的长入，骨缺损处即因纤维组织的阻隔发生骨不连[7]。早在1988年Dahlin等[8]就指出，骨缺损两骨端间的成骨速度必须超过骨折周围纤维组织的生长速度，才能确保骨折断端不被纤维组织嵌入阻隔，骨再生才能顺利进行。因此，隔膜的作用是将结缔组织阻挡于骨缺损之外，排除干扰，为骨再生提供一个独立的空间，并引导骨缺损区域两骨端向缺损区域生长。同时，隔膜将骨折局部的诱导因子浓缩，使绝大多数诱导因子集中于骨缺损区域，诱导骨膜及骨髓中骨原细胞成骨，加快骨缺损区域的修复，促进骨折愈合。 2.2.4 膜引导性骨再生的机制 目前应用于骨缺损动物实验模型的各种膜材料均是被缝合或加工成管状套接于骨缺损两端，故可将引导性骨再生的膜称为膜管。各种膜管发挥引导性骨再生的机制可能包括了上述3种骨修复的机制：首先，各种膜管都具有一定的机械强度，可以阻隔骨折周围生长较快的纤维组织向骨缺损内生长，使膜管内骨缺损区具有良好的独立空间，允许成骨细胞在其内部生长，膜管还可稳定和保护膜管内血肿和微循环血管形成，目前各种膜管的机械强度均有一定的应力性，能更好地保护骨缺损区域的空间形态，但是应力性不够强，不能起到完全的承重作用，需要其他固定物辅助；其次膜管均具备较好的生物相容性，可以作为一种支架，使源自骨膜、骨髓的骨生成细胞在其表面贴附，进而增殖分化为成骨细胞；在此过程中膜管还起到募集来源于骨膜和髓内促骨细胞生长因子的作用，使骨缺损内生长因子不断聚集并促进间充质细胞向成骨细胞分化，即诱导新骨形成。Minabe[9]认为在引导性骨再生过程中，膜下间隙对骨再生的形状和量起决定作用。 有研究通过观察隔膜技术下引导性骨再生组织学过程及骨形态发生蛋白、转化生长因子β、碱性成纤维细胞生长因子的表达规律，进而结合骨诱导理论探讨引导性骨再生的机制。实验在成年雄性新西兰兔双侧桡骨中段制作10 mm标准骨缺损不愈合模型，随机选择一侧为实验侧，用硅胶膜成管状包裹骨缺损，另一侧为对照侧，术后分别进行组织学及骨形态发生蛋白、转化生长因子β、碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体的免疫组织化学染色和cDNA探针原位杂交观察。结果显示，组织学发现隔膜能够在骨缺损处形成密闭腔室，隔膜管内骨折端各种细胞增殖共同形成肉芽组织，占据骨缺损并提供成骨细胞来源；术后在不同的时间由不同的细胞表达碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、骨形态发生蛋白，两组中无明显不同；3种骨诱导因子在实验组总体含量明显高于对照侧(P < 0.001)。结果表明引导性骨再生成功的关键是由于隔膜在骨折局部形成了一个相对独立的骨再生环境，排除了周围组织的干扰，能够防止骨诱导因子扩散，使骨缺损局部的骨诱导因子含量相对增加，最终成功地诱导骨再生修复骨缺损。 Kubota等[10]也认为膜引导性骨再生实施中的膜管应当具有相当强度，以抵抗周围组织的压迫而变形。Leiggener等[11]将聚乳酸化合物植入缺损区作支撑作用，以确保膜下空间的维持。Giardino等[13]在兔桡骨骨缺损区放置脱钙异体骨基质、外包聚乳酸膜，3个月后新骨生成量明显优于对照组。Donos等[12]将自体骨移植至骨缺损区，覆盖聚四氟乙烯膜，发现移植骨片吸收比对照组明显减慢，并保持更长期的体积稳定性。Becker等[14]在兔桡骨中段骨缺损间放置膜的实验中发现，成骨细胞可以沿膜管内壁爬行，且由骨缺损两端向中央生长，即膜管起骨传导作用，同时还证实了膜管内的内源性骨形态发生蛋白高于膜管外。张浩等[15]对用硅胶管套接的兔桡骨骨缺损进行了骨形态计量学研究，证实膜管内与膜管外成骨过程性质不同，膜管内再生为膜内化骨过程，而膜管外成骨是由可诱导性成骨细胞参与以软骨内化骨过程为主的成骨过程。虽然膜内成骨的早期再生骨组织细胞来源有限，但中晚期定向骨形成细胞达到一定数量，其成骨过程加快，并且成骨过程持久。随着人工合成可降解膜管的研究，目前已有将药物和促骨生长因子与膜管共聚形成控释性膜管，用于治疗骨缺损和感染性骨病，但尚需进一步的研究。 有研究评估碱性成纤维细胞生长因子对于膜引导性骨再生的作用。实验取40只成年新西兰大白兔，以聚-DL-乳酸膜建立经典的兔桡骨缺损膜引导性骨再生模型，实验侧膜管内加入游离碱性成纤维细胞生长因子400 mg/L，对照侧膜管内加入100 μL的生理盐水，术后2，4，8，12周分别处死动物，行大体观察、X射线摄片、组织学观察和图像分析以及骨生物力学检测。术后2周，可见隔膜两端的软组织已覆盖隔膜管，使其形成完全密闭的腔室；术后12周，     聚-DL-乳酸膜管仍保持完整的外形。组织学显示，术后2周，碱性成纤维细胞生长因子组两骨断端均有较多的新生骨小梁形成；术后12周，碱性成纤维细胞生长因子组缺损完全愈合，开始重塑改建；术后2，4周，碱性成纤维细胞生长因子组膜管内新生骨小梁平均面积、直径均与空白对照组比较明显增加(P < 0.05)；术后8周和12周，两组膜管内骨小梁平均面积、直径差异无显著性意义(P > 0.05) ；12周时除了破坏挠度值，碱性成纤维细胞生长因子组新生骨生物力学指标优于对照组(P < 0.05) 。因此，作者认为外源性碱性成纤维细胞生长因子能够促进膜引导性骨再生及其生物力学性能的恢复。 2.3 骨缺损的治疗方法 目前骨缺损的治疗方法已经发展到多个选项可用于骨缺损的重建，包括骨缩短与延长或骨运输和“对接”(牵引成骨技术为基础)，vascularised的使用和non-vascularised骨移植，骨代用品，干细胞，生长因子，支架和基因治疗[30]。Udehiya等[31]认为自生和外源的骨髓源性间充质干细胞在修复骨缺损时均具有相当重要的作用，但是外源的骨髓源性间充质干细胞在修复骨缺损时速度更快，更好和便于控制。Borzunov 等[32]认为Ilizarov非自由骨成形术技术的多级片段和渐进单程延长的tibilisation腓骨可以用来治疗广泛的胫骨缺损，腿的长度差异和畸形的更正，并且此方法能够扩展到四肢。生物材料的应用在骨缺损修复中也起到一定作用，Chen等[33]认为一种半合成的水凝胶材料酚醛，可以调节释放生理剂量的人重组骨形态发生蛋白2，基于其可控的物理性质和生物降解在颌面部骨缺损的治疗中具有一定的可行性。在组织工程学上的研究目前也有一定的进展，Liu 等[34]认为同种异体脂肪组织衍生干细胞在颅骨缺损修复方面有再生能力，可作为骨组织工程的种子细胞。 2.4 膜管的分类、性能和优缺点 根据材料来源可将膜管分为：非生物性材料，如聚四氟乙烯、聚乳酸、硅胶、钛膜等；生物性材料，如胶原膜、几丁质膜、聚羟基丁酸酯等。按材料能否降解又可分为：非降解性材料，如聚四氟乙烯；降解性材料，如胶原膜、聚乳酸、聚乙醇酸。将常用的降解性和非降解性材料膜管及其性能总结如下： 2.4.1 非降解性材料的特点 新骨完全形成于膜管内，成骨过程中膜管不能被组织吸收，不会被替代，此类膜研究时间较久，经验也较多，有的膜已成成品被应用于口腔疾病的治疗，厚度一般为0.5 mm，组织相容性好，引导性骨再生效果较好，但需二次手术取除膜管。主要材料有：聚四氟乙烯膜，生物惰性大，组织相容性好，相关研究较多，主要用在口腔颌面不骨缺损的治疗，已经有商品化膜供口腔临床使用，有确定的引导成骨效果[16-18]，但价格较高，作为管状骨骨缺损模型应用于动物治疗的报道极少；硅胶膜管，是多数引导性骨再生动物实验所选用的材料，取材方便，价格便宜。用临床使用的导尿管即可裁剪、缝合制成，引导骨再生也有较好效果，但不能临床使用。 有研究探讨硅胶膜管与骨形态发生蛋白和羟基磷灰石复合后修复兔长骨缺损的效果。实验制备兔桡骨中段1.2 cm缺损模型，实验组缺损区外围包绕硅胶膜，其内分别填充自体骨、骨形态发生蛋白/羟基磷灰石、羟基磷灰石三种材料；对照组仅填充羟基磷灰石；空白组骨缺损区未填充，通过X射线摄片、光学显微镜、立体计量学分析和生物力学评价对骨缺损区愈合效果进行分析。结果显示，术后1个月，硅胶膜+骨形态发生蛋白/羟基磷灰石组骨缺损区见有大量的类骨质，明显优于其他组；第2个月，硅胶膜+自体骨组与硅胶膜+骨形态发生蛋白/羟基磷灰石组植入区有大片新骨形成；术后3个月，硅胶膜+自体骨组与硅胶膜+骨形态发生蛋白/羟基磷灰石组骨缺损基本修复并出现骨组织改建现象。此时，硅胶膜+羟基磷灰石组与对照组骨缺损区也有少量新骨形成，空白组缺损区为纤维组织充填。结果表明硅胶膜管与自体骨或骨形态发生蛋白/羟基磷灰石联合用于修复骨缺损成骨效果更佳，因为硅胶膜的屏障作用可使骨缺损区受到引导成骨和诱导成骨的双重作用。 2.4.2 降解性材料的特点 可降解性材料具有组织相容性好、无细胞毒性特点，可在植入后一定时期内降解，部分膜还可以允许组织液和营养物质自由交换，但存在降解时间不易控制，膜管下容积难以维持的缺陷。 胶原膜：胶原膜为可降解性膜，能在宿主体内安全降解及被骨组织完全替代，Wiltfang等[19]和Teparat等[20]的实验证实胶原膜早期成骨作用效果好。但胶原膜质较软，膜管完全降解时间仅6周左右，2周时已有明显降解迹象，所以胶原膜管固定困难、膜下空间难以维持[21-22]。在动物实验中学者们在膜管内放置表面脱钙异体骨[23]，减少或消除了膜的移位、塌陷，并使膜下空间得以更好的维持，修复效果较好。 有研究探讨骨形态发生蛋白与胶原膜复合物(复合膜)修复大鼠颅骨缺损的效果，实验将骨形态发生蛋白与胶原膜复合，在大鼠颅骨制备骨缺损，分别采用双侧覆盖复合膜、外侧覆盖复合膜进行治疗，以外侧覆盖胶原膜作为平行对照，并设空白对照；于术后2，4，6周，取标本进行X射线检查及组织学观察。结果显示，两个覆盖复合膜组的缺损成骨面积百分比明显高于覆盖胶原膜的平行对照组(P < 0.01)；术后4，6周，双侧覆盖复合膜组的成骨面积百分比明显大于单侧覆盖复合膜组(P < 0.05)，双侧覆盖复合膜组的缺损术6周后已达骨性愈合，表明骨形态发生蛋白与胶原膜复合既具有机械性阻挡作用，又具有骨诱导性，能加速骨缺损愈合。 另有研究观察胶原膜引导骨组织再生的形式，了解膜的理化特性、降解情况，并探讨引导悱骨再生的机制。实验制作成年新西兰兔造成10 mm桡骨缺损，实验组缺损处移植胶原膜及表面脱钙异体骨，对照组仅移植表面脱钙异体骨，并行X射线、组织学及免疫组化检查。结果显示，实验组移植区域存在明显骨膜反应，新骨增生明显，骨重建顺利，骨缺损完全修复；对照组移植区域由于纤维结缔组织的占据，新骨生长及成熟骨替代均较实验组延缓，表明胶原膜能有效发挥阻隔与引导的作用，同时膜管能使内、外源性骨形态发生蛋白不断聚集，有效分布，骨形态发生蛋白分布特征影响着组织细胞及骨愈合方式。 人工合成材料膜：为人工合成可降解型膜管，较其他膜管具有较高的力学强度；降解时间为4-18个月，较胶原膜降解时间长，足以在骨修复全程维持充膜管下容积；膜管表面可降解，具有细胞吸附作用，允许膜管内表面骨膜来源的成骨细胞沿内壁爬行，使骨缺损由两端向中间生长。目前研究最多的是聚乳酸、聚乙醇酸及两者的共聚复合物。虽然此类材料在动物实验效果确定，但动物体质量小，前臂上段尺桡骨可自然愈合，使骨缺损不需外固定即可达到较好的固定效果。根据目前的研究结果，此类材料膜管若单独应用于人长骨缺损仍存在力学强度不足，不同批材料降解速率不稳定等不足，临床使用尚需进一步研究。 有研究观察可降解聚-DL-乳酸膜引导兔桡骨缺损再生的现象，并探讨其作用和机制。实验取40只成年新西兰大白兔建立双侧桡骨缺损模型，左侧为实验侧，以聚-DL-乳酸膜卷成管状桥接骨缺损；右侧为对照侧，桡骨缺损不做处理，术后2，4，8，12周分别处死动物，行大体观察、X射线摄片、组织学观察和骨生物力学检测。结果显示，实验侧术后2周，可见隔膜管两端已为软组织覆盖，膜管外两端可见多量新生骨痂形成，膜管内骨断端间充满与膜管形状相适应的血肿和纤维骨痂；术后12周膜管颜色明显变白，仍然保持原有外形无塌陷，膜管外骨痂已基本消失，膜管内骨缺损均已骨性愈合；对照侧术后2周骨缺损区被大量的结缔组织充填，12周时无一例愈合，骨断端均已封闭而形成典型的骨不连；对照侧均不能进行力学测试，实验侧12周组新生骨的生物力学指标明显优于8周组(P < 0.05)。因此，聚-DL-乳酸膜能够成功引导骨再生，可以用于临床治疗骨缺损和骨不连。 膜管的应用是引导性骨再生过程的关键，可吸收、组织相容性好的膜材料是发展的方向。有实验探讨聚乳酸膜管在引导性骨再生中应用的可能性。实验选择 30只成年新西兰大白兔，实验侧断端用聚乳酸膜管包裹，另一侧不作处理作为对照组，术后1，3，6，9，12周分别处死动物，标本行X射线、组织学检查。结果显示，对照组无一例骨缺损修复，骨断端间被增生的纤维结缔组织所占据；而实验侧新生骨在9，12周时沿膜管内层连接两断端，聚乳酸膜管具有良好的生物相容性，随时间降解。结果表明：①利用膜管引导性骨再生可以有效的修复骨缺损。②聚乳酸膜具有良好的生物相容性，对机体无不良反应。③引导性骨再生的机理可能与膜将周围组织隔离、保护血肿、维持膜下间隙提供骨再生的微环境有关。"